N端測序 edman法檢測服務(wù)
N端測序 edman法檢測服務(wù)
樣品要求
樣品狀態(tài)：可以是干粉，溶液（不接受PVDF膜樣品）；
樣品濃度及純度：總量>200ug 純度>90% 濃度>0.5mg/ml；
如需測試氨基酸個(gè)數(shù)比較多，建議總量在2mg-3mg，純度95%或以上，濃度1mg/ml
含鹽量：揮發(fā)性無機(jī)鹽< 20 mM, 不揮發(fā)性無機(jī)鹽< 5mM, 建議不使用Tris緩沖體系，建議提供樣品的理論序列
測序樣品不返還，請保留備份
儀器簡介
Edman化學(xué)降解法是蛋白質(zhì)N-端測序技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)，其基本原理是包括通過異硫氰酸苯脂（PITC）與蛋白質(zhì)的N-端殘基的偶聯(lián)，苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）環(huán)化裂解，和噻唑呤酮苯氨（ATZ）轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）三個(gè)主要的化學(xué)步驟，每個(gè)循環(huán)從蛋白質(zhì)N端裂解一個(gè)氨基酸殘基，同時(shí)暴露出新的游離的氨基酸進(jìn)行下一個(gè)Edman降解，然后通過轉(zhuǎn)移的PTH-氨基酸鑒定實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的測定。
Edman測序法是一種用于鑒定蛋白質(zhì)序列的測序技術(shù)。純化好蛋白質(zhì)后，確認(rèn)需要檢測的某個(gè)序列，并把這個(gè)序列還原成更小的片段（如果要測的蛋白質(zhì)很大的話，那就需要將蛋白質(zhì)還原成更小更小的片段）之后，就可以使用Edman測序法來檢測蛋白序列了。Edman測序法可以直接分析氨基酸信息，并且不需要借助任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，因此，Edman測序可以對(duì)全新的沒有數(shù)據(jù)庫信息的蛋白質(zhì)進(jìn)行N端序列分析。
盡管Edman法技術(shù)已應(yīng)用較多，但仍有不足之處，例如Edman降解法不能解決N端封閉的測序問題（環(huán)化、封閉）、被修飾的蛋白不能給出確切的信號(hào)，銘研生物在此技術(shù)基礎(chǔ)上加入質(zhì)譜法，質(zhì)譜法不受N末端封閉的限制，能對(duì)側(cè)鏈基團(tuán)翻譯后加工或化學(xué)修飾進(jìn)行定位，靈敏度有提高，因而具有其優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)的Edman降解法相互補(bǔ)。
Edman測序是如何進(jìn)行的？
1. 耦合（Coupling），使用異硫氰酸苯酯（也稱為PITC）與蛋白樣品進(jìn)行反應(yīng)。這種試劑的作用是在溫和的堿性條件下與氨基的N端反應(yīng)，形成苯硫氨酰（PTC）加合物;
PITC結(jié)構(gòu)圖
2. 分離（Cleavage），在強(qiáng)酸的作用下，對(duì)N末端氨基進(jìn)行切割。因?yàn)槊看沃磺谐┒说淖詈笠粋€(gè)氨基，循環(huán)進(jìn)行，直到切除最后一個(gè)氨基，即可獲取全部序列信息;
3. 轉(zhuǎn)換（Conversion），將與PITC結(jié)合的殘基轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定的PTH殘基，進(jìn)行后續(xù)測定步驟（這步使得結(jié)構(gòu)變得更穩(wěn)定）。
原理圖：
常見問題
1.不確定我的樣品的N端是否封閉怎么辦？
可以按照正常流程測試，但是會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種情況下我們是正常收費(fèi)的，請理解。
2.蛋白純度沒有95%，只有92%可以嗎？
可以嘗試，但本平臺(tái)無法保證結(jié)果符合預(yù)期。
