西尼羅河病毒IgG檢測試劑盒

【預(yù)期用途】

該試劑盒利用了西尼羅重組抗原檢測人體血清或血漿中的西尼羅抗體。本實(shí)驗(yàn)僅用于輔助診斷人感染了西尼羅病毒，不用于篩查血液或血液成分。僅供專業(yè)人員體外診斷使用。

【前言簡介】

感染了西尼羅病毒會導(dǎo)致包括腦炎等一系列癥狀的疾病，西尼羅病毒在世界廣泛傳播，已在50多個國家檢測出該病毒。本試驗(yàn)經(jīng)CDC提供的試劑檢驗(yàn)與驗(yàn)證。本試驗(yàn)使用了一種稱為WNRA的重組抗原，它可以作為西尼羅病毒感染的快速血清學(xué)指標(biāo)，WNRA蛋白是一種重組抗原，它是由含有西尼羅病毒兩個抗原的序列多肽構(gòu)成。 

【檢測原理】

該試劑盒是基于兩步夾心法原理。在該測定中，將微量滴定孔與標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控或未知血清樣品孵育?？梢詫⒀鍢悠放c孔中添加的樣品稀釋緩沖液直接混合（另請參見以下說明）。洗滌后，將孔用對人IgG特異的抗體處理，并用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記。在第二溫育和洗滌步驟之后，將孔與四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溫育。

然后加入酸性終止溶液，并通過在450納米處的吸光度測量來確定底物的酶促轉(zhuǎn)化程度。高于某個閾值時，WNRA和質(zhì)控孔的吸光度之比可以準(zhǔn)確確定是否存在針對WNV的抗體。提供一組陽性和陰性樣品作為內(nèi)部質(zhì)控，以監(jiān)測試劑盒的完整性。 

【試劑盒組成成分】

1.   微孔板：       （96孔 12x8）即用型，每孔均包被結(jié)合西尼羅重組抗原的單抗。2－8℃下保存至保質(zhì)期。注意：WNRA和NCA已包被于微孔板。

2.   IgG樣品稀釋液：1×25ml，即用 2-8℃下保存至效期。

3.   IgG陰性質(zhì)控：  1×30ul，2-8℃下保存至效期。要長時間儲存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲存。

4.   IgG陽性質(zhì)控：  1×30ul，2-8℃下保存至效期。要長時間儲存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲存。

5.   洗滌液（10X）：  1×120ml，2－8℃下保存至效期。

6.   EnWash：        1×20ml， 2－8℃下保存至效期。

7.   酶聯(lián)物：        1×6ml，即用型，2－8℃下保存至效期。

8.   TMB底物液：   1×9ml，即用型，2－8℃下保存至效期。

9.   終止液：        1×6ml，即用型，2－8℃下保存至效期。

試劑應(yīng)避免反復(fù)凍融。

【操作步驟】

在使用前將所有試劑和樣品平衡至室溫，并輕輕倒轉(zhuǎn)使其充分混勻。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

將10X的濃縮洗滌液稀釋,將120ml的濃縮洗滌液加上1080ml的蒸餾水，搖勻，至無任何沉淀，稀釋好的洗滌液最多可在室溫下放置兩個星期。

準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的板條，剩余的板條應(yīng)盡快放入袋子里重新密封，在2－8℃下儲存至保質(zhì)期。 

操作步驟：

1.  標(biāo)記將要使用的板條，注意微孔板已經(jīng)按照統(tǒng)一排列，如下所述包被西尼羅抗原和質(zhì)控抗原。

2.  將血清樣品﹑陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控同樣地用樣品稀釋液按1：300稀釋。

3.       每孔加入50ul稀釋后的樣品，以下為一個血清樣品使用一個板條的典范。

4.       封板，在濕潤的溫育器里37℃下溫育1小時。

5.       溫育后，用自動洗板機(jī)，使用洗滌液洗板6次。

6.       在每孔中加入50ul的酶聯(lián)物。

7.       封板，在濕潤的溫育器里37℃下溫育1小時。

8.       溫育后，用自動洗板機(jī)，使用洗滌液洗板6次。

9.       每孔加入150ul的EnWash，在室溫下溫育5分鐘

10.   溫育后，用自動洗板機(jī)，使用洗滌液洗板6次。

11.   每孔加入75ul的TMB底物液。

12.   封板，在室溫下，避光處溫育10分鐘。

13.   每孔加入50ul的終止液終止反應(yīng)。

14.   在450nm處讀取吸光率。

【結(jié)果計算】

結(jié)果的變化將會非常大，以下結(jié)果僅供指引。

計算ISR值：

計算在同一實(shí)驗(yàn)里WNR抗原的兩個陰性質(zhì)控的平均值，計算同一實(shí)驗(yàn)里NC抗原的兩個陰性質(zhì)控的平均值，用WNRA/NCA，得出陰性質(zhì)控的ISR值。同樣地計算陽性質(zhì)控和樣品得ISR值，陽性質(zhì)控的ISR值應(yīng)高于3.0，陰性質(zhì)控的ISR值應(yīng)低于1.5。

結(jié)果的判斷：

在某些特殊的例子中，曾報道有假陽性，但對梅毒病人無限制。假如樣品的ISR值大于2.0，但是WNRA和NCA的OD值均偏低，可視為潛在假陽性。以下為樣品1排除標(biāo)準(zhǔn)的范例。

排除標(biāo)準(zhǔn)：

計算陰性質(zhì)控的WNRA和NCA值：

平均WNRA=0.260/2=0.130

     NCA=0.236/2=0.118

     ISR=0.130/0.118=1.10

任何陰性質(zhì)控的ISR值高于1.5，則實(shí)驗(yàn)需要重做。

計算陽性質(zhì)控的WNRA和NCA值：

平均WNRA=1.290/2=0.645

     NCA=0.368/2=0.184

     ISR=0.645/0.184=3.5

任何陽性質(zhì)控的ISR值低于3.0，則實(shí)驗(yàn)需要重做。

以下標(biāo)準(zhǔn)是必需遵守的，不滿足以下標(biāo)準(zhǔn)，試劑出現(xiàn)了質(zhì)量問題或操作錯誤，實(shí)驗(yàn)需重做。

【解釋結(jié)果】

1.       樣品的ISR值大于3.0視為陽性。

2.       陽性結(jié)果需重做證明。

3.       樣品的ISR值小于2.0視為陰性。

4.       樣品的ISR值小于3.0但是大于2.0，視為未確定，但是很有可能陽性，實(shí)驗(yàn)需一式三份重做。

5.       ISR值大于2.0是因?yàn)閃NRA和NCA的值都低造成的，應(yīng)該視為潛在假陽性。

樣品1低OD值的范例：
計算樣品的WNRA和NCA值：

平均WNRA=0.060/2=0.030

   NCA=0.026/2=0.013

   ISR=0.030/0.013=2.31

雖然樣品的ISR值高于2.0，但是本樣品需視為假陽性，因?yàn)槠銸D值低，而且遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)品，這通常在空白值高的情況下發(fā)生。 

【局限性】

1. 樣品的OD值高于抗原質(zhì)控（非WNRA）,導(dǎo)致ISR值小于3.0，則可能為假陰性，再釋稀樣品重新實(shí)驗(yàn)，可能會獲得真正的ISR值。

2. 既然這不是一個直接檢測的方法，則需考慮假陽性和假陰性存在的可能性。

3. 所有有反應(yīng)的樣品，應(yīng)用確定性實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

4. 本實(shí)驗(yàn)提供的試劑，盡可能地檢測血清或血漿中的WNRA反應(yīng)性抗體水平。

5. 應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品和試劑。

6. 不要使用溶血或脂血的樣品，它們會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。

華南生物工程有限公司作為澳大利亞PANBIO、日本生研、Thermo、德國NOVATEC、德國賽維、德國Genecam、德國DRG、MERCKE、德國IBL、德國genekam、美國InBios、美國CORTEZ、美國FULLER、日本IBL、比利時CORIS等多家國際檢測產(chǎn)品公司的中國代理商，希望能更好的滿足您的需要，我們能夠?yàn)槟峁┒嗥贩N、多方法、 多系列的檢測產(chǎn)品，保證穩(wěn)定快速供貨。。

【僅供科研】