PCR基因擴(kuò)增儀反應(yīng)體系的組成及其作用

  PCR（Polymerase Chain Reaction）反應(yīng)，中文譯為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外（試管、切片…）擴(kuò)增核酸的技術(shù)。PCR的基本反應(yīng)包括以DNA為模板的反應(yīng)和以mRNA為模板的反應(yīng)。
PCR反應(yīng)是模擬體內(nèi)天然DNA（脫氧核糖核酸）的復(fù)制過(guò)程。以擴(kuò)增DNA為例，其基本原理是在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。
PCR反應(yīng)一般設(shè)置20～40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板。PCR的擴(kuò)增效率很高，如果循環(huán)次數(shù)是30次，那么新生DNA片段理論上達(dá)到230拷貝（約為109個(gè)分子）。
PCR反應(yīng)每個(gè)循環(huán)的三個(gè)基本反應(yīng)步驟如下：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：溫度升到72℃左右，DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
重復(fù)循環(huán)變性－－退火－－基因擴(kuò)增儀https://www.jntckj.cn/延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期（Plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性。

PCR反應(yīng)體系的組分及各組分的作用總體積：一般為25μl～100μl一、Mg2+:終濃度為1.5～2.0mmol/L，其對(duì)應(yīng)dNTP為200?μmol/L，注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系，由于dNTP與Taq酶竟?fàn)嶮g2+，當(dāng)dNTP濃度達(dá)到1?mmol/L時(shí)會(huì)抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。二、無(wú)Mg2+buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度，但不能超過(guò)50?mmol/L，否則會(huì)抑制DNA聚合酶活性。三、BSA：一般用乙?；腂SA，起著減少PCR管對(duì)Taq酶的吸附作用，對(duì)Taq酶有保護(hù)作用。四、底物（dNTPs）：dNTPs具有較強(qiáng)酸性，其儲(chǔ)存液用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.5，一般存儲(chǔ)濃度為 10 mmol/L，各成份以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應(yīng)，但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高性，而反應(yīng)速度會(huì)降低。五、Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其適pH值為8.3～8.5，適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ)，按5’→3’方向逐個(gè)將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。無(wú)3’→5’的外切酶活性，沒(méi)有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過(guò)高,會(huì)增加其錯(cuò)配率?；驍U(kuò)增儀用量一般為0.5～5個(gè)單位/100μl。六、模板：PCR對(duì)模板DNA的純度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高，否則擴(kuò)增可能不會(huì)成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。七、引物：引物濃度一般為0.1～0.5μmol/L，濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過(guò)低。引物長(zhǎng)度一般15～30個(gè)堿基，引物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對(duì)，末位堿基選用A、C、G（因T錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的延伸）。引物G+C約占45～55%，堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。