基于毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)的PA800 plus生物制品分析系統(tǒng)

    貝克曼庫爾特公司于2009年發(fā)布了新的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)PA800 plus，用于生物制品的研發(fā)及質(zhì)量控制。目前毛細(xì)管電泳技術(shù)已經(jīng)成為重組蛋白、單克隆抗體及純化疫苗等生物制品研發(fā)與質(zhì)量控制中的關(guān)鍵技術(shù)之一，并在逐漸取代原有的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、等電聚焦凝膠電泳(IEF)等方法，作為生物制品純度測(cè)定、等電點(diǎn)確認(rèn)、糖基化分析等方面的新標(biāo)準(zhǔn)?；诿?xì)管電泳技術(shù)的PA800 plus生物制品分析系統(tǒng)具有以下幾個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：

    · 高重復(fù)性，定量RSD < 1%，定性（pI）RSD < 0.1%；
    · 高分析速度，純度分析<30分鐘；pI測(cè)定<40分鐘；糖基化分析<15分鐘；
    · 自動(dòng)化程度高；
    · 節(jié)省樣品和試劑，進(jìn)樣量為納升級(jí)；
    · 糖基化分析具有極高的靈敏度；

     我們所熟知的重磅炸彈級(jí)蛋白質(zhì)藥物(如Avastin、Herceptin、Rituxin及Xolair等)的研發(fā)與質(zhì)量控制中無不使用CE技術(shù)。從培養(yǎng)基優(yōu)化、克隆篩選、配方穩(wěn)定性研究和純化過程監(jiān)測(cè)，到蛋白質(zhì)表征、相關(guān)雜質(zhì)檢測(cè)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定和產(chǎn)品的質(zhì)量控制，蛋白質(zhì)藥物研發(fā)和生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)都需要使用到毛細(xì)管電泳。蛋白質(zhì)的純度測(cè)定，已經(jīng)從SDS-PAGE逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镃E方法；蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定，毛細(xì)管等電聚焦比傳統(tǒng)膠條方法更為準(zhǔn)確；糖蛋白藥物的糖基不均一性表征，毛細(xì)管電泳是高分辨率的方法。在擁有超過120臺(tái)CE的基因技術(shù)公司(Genetech，已被羅氏收購)實(shí)驗(yàn)室中，幾乎所有的傳統(tǒng)電泳實(shí)驗(yàn)，如SDS-PAGE純度檢測(cè)、IEF的等電點(diǎn)檢測(cè)和糖蛋白的糖基化分析都已經(jīng)轉(zhuǎn)移到CE技術(shù)平臺(tái)上。在安進(jìn)公司(Amgen)的實(shí)驗(yàn)室中也有著由幾十臺(tái)CE所構(gòu)成的龐大的質(zhì)量分析和控制系統(tǒng)，負(fù)責(zé)所有出廠蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量控制(純度和異質(zhì)性測(cè)定)。
 

    毛細(xì)管電泳技術(shù)在生物制品研發(fā)和質(zhì)量控制中的發(fā)展

    毛細(xì)管電泳技術(shù)用于生物制品的研發(fā)與質(zhì)量分析起始于美國的各大生物制藥公司。隨后這項(xiàng)技術(shù)迅速而廣泛地被歐洲、日本、新加坡等地的新藥研發(fā)和生產(chǎn)中心所接受，目前在生物制藥公司中運(yùn)行的毛細(xì)管電泳儀已經(jīng)超過600臺(tái)，而且使用量越來越大。
     由于越來越多的生物制藥公司使用毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行鑒定和質(zhì)量分析，F(xiàn)DA等法規(guī)機(jī)構(gòu)也開始關(guān)注對(duì)CE技術(shù)在生物制品分析中的適用性。在2006年，由惠氏、安進(jìn)、基因技術(shù)、禮來、輝瑞、強(qiáng)生及加拿大衛(wèi)生署等超過10個(gè)實(shí)驗(yàn)室組成的項(xiàng)目研究小組對(duì)CE技術(shù)在生物制品分析中的穩(wěn)定性、可靠性、準(zhǔn)確性等多方面進(jìn)行了研究和考察(Chromatographia, 2006, 64, 359-368)。研究結(jié)果表明CE技術(shù)比傳統(tǒng)的凝膠電泳方法更適合生物制品的表征與質(zhì)量控制，結(jié)果的穩(wěn)定可靠性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)使用的凝膠電泳技術(shù)。該正式建議各生物制藥公司使用CE技術(shù)代替原有的凝膠電泳技術(shù)作為研發(fā)與質(zhì)量分析的平臺(tái)，同時(shí)也建議FDA等法規(guī)機(jī)構(gòu)規(guī)定使用CE技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)相關(guān)藥物檢測(cè)。為了不斷追求更高的質(zhì)量要求，拜耳制藥也曾向FDA其一例蛋白質(zhì)藥物的原有SDS-PAGE純度測(cè)定方法并不準(zhǔn)確，而CE方法能夠得到更為準(zhǔn)確的純度測(cè)定結(jié)果，因此申請(qǐng)將原有的純度檢測(cè)方法由SDS-PAGE改為CE。
     事實(shí)上，F(xiàn)DA官員也非常傾向于在新生物制品的報(bào)批材料中使用CE技術(shù)作為等電點(diǎn)、純度、糖基化等數(shù)據(jù)的測(cè)定手段。對(duì)于傳統(tǒng)凝膠電泳的數(shù)據(jù)，F(xiàn)DA官員對(duì)其可靠性及準(zhǔn)確性持保留態(tài)度，而CE得到的數(shù)據(jù)要比凝膠電泳準(zhǔn)確的多，這是FDA官員非常愿意接受CE技術(shù)結(jié)果的主要原因。2008年，諾華公司位于意大利的疫苗研發(fā)中心(NVGH)開發(fā)的新型蛋白質(zhì)抗原疫苗在報(bào)批時(shí)由于使用SDS-PAGE作為純度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)DA官員對(duì)其數(shù)據(jù)可靠性質(zhì)疑，并非常明確的建議其使用CE技術(shù)重新對(duì)純度進(jìn)行檢測(cè)。
     在歐洲藥典及美國藥典中，毛細(xì)管電泳的檢測(cè)方法也不斷豐富與發(fā)展。毛細(xì)管電泳技術(shù)早出現(xiàn)在藥典中的方法是促紅細(xì)胞生成素(EPO)的糖異構(gòu)體測(cè)定，及得到不同糖型EPO異構(gòu)體之間的百分比例。糖蛋白的異構(gòu)體差異是非常微小的，普通的分析方法不能將EPO主要的幾種異構(gòu)體分離定量。Amgen公司使用CE技術(shù)解決了EPO產(chǎn)品中各種糖基化異構(gòu)體的分離定量問題，這一方法即被歐洲藥典和美國藥典確定為EPO分析的標(biāo)準(zhǔn)。2005年歐洲藥典委員會(huì)組織14家實(shí)驗(yàn)室及生物制藥廠家進(jìn)行了重組生長激素(Somatropinum)的CE分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果一致表明CE比膠條等電聚焦方法更準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)單、快速。在2006年歐洲藥典增補(bǔ)版上，這一方法被列為生長激素大分子相關(guān)雜質(zhì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。目前在歐洲藥典上已經(jīng)有包括EPO、重組生長激素、谷胱甘肽、抑肽酶等超過10種的藥品需要用CE方法來進(jìn)行檢定。隨著CE技術(shù)在生物制藥領(lǐng)域的快速發(fā)展，以及新的蛋白質(zhì)藥物/疫苗的不斷上市，將會(huì)有更多的CE方法出現(xiàn)在各權(quán)威藥典中。

    蛋白質(zhì)生物制品的分子量和純度分析

     PA800 plus生物制品分析系統(tǒng)采用毛細(xì)管電泳技術(shù)全自動(dòng)地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定、純度測(cè)定。在線紫外檢測(cè)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，無須傳統(tǒng)繁瑣的制膠和染色程序，因此可快速地完成蛋白質(zhì)的鑒定。樣品的準(zhǔn)備過程與SDS-PAGE大體相同，而分離和檢測(cè)在毛細(xì)管中進(jìn)行。采用了新優(yōu)化的凝膠配方，以確保廣泛分子量范圍的各種蛋白質(zhì)均可獲得的分辨和檢測(cè)效果。ProteomeLab SDS-MW凝膠分析試劑盒（ProteomeLab SDS-MW gel analysis kit) , 對(duì)分離凝膠介質(zhì)進(jìn)行了優(yōu)化, 并將操作方法和數(shù)據(jù)處理做了標(biāo)準(zhǔn)化, 使分子量的測(cè)定更加簡(jiǎn)單、方便、自動(dòng)和準(zhǔn)確。該試劑盒內(nèi)包括標(biāo)準(zhǔn)操作方法、對(duì)照品、樣品緩沖液和凝膠緩沖液。
     SDS-PAGE方法對(duì)蛋白藥物進(jìn)行純度分析，不僅穩(wěn)定性不佳，而且分辨率不夠，已經(jīng)不能滿足生物制品研發(fā)和質(zhì)量控制的要求。ProteomeLab IgG純度/異質(zhì)性分析試劑盒（ProteomeLab IgG Purity/Heterogeneity AssayKit），特別用于分析鑒定變性和非變性免疫球蛋白等IgG 的性質(zhì)，分辨率高，可分離出非糖基化重鏈等雜質(zhì)。其方便、簡(jiǎn)單和標(biāo)準(zhǔn)化的方法更是市場(chǎng)上的。例如對(duì)于單克隆抗體藥物的純度測(cè)定，SDS-PAGE并沒有將樣品中的雜蛋白分離出來，特別是丟失糖鏈的重鏈。而毛細(xì)管電泳技術(shù)不僅分別率高，而且速度也很快，只需要20幾分鐘即可完成。
      這一方法的穩(wěn)定性較傳統(tǒng)SDS-PAGE方法高得多，如一個(gè)單克隆抗體蛋白的純度測(cè)試，連續(xù)19次進(jìn)樣，得到的結(jié)果定量RSD（峰面積）<1%；定性RSD（出峰時(shí)間）<1% 。
 

    蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定和蛋白質(zhì)異質(zhì)性的鑒定

    根據(jù)蛋白質(zhì)電荷特性的差異可區(qū)分鑒別蛋白, 因此通過測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),可以部分地確定蛋白質(zhì)的屬性。通過對(duì)所分離的不同蛋白質(zhì)變異株的定量，可以評(píng)估其異質(zhì)性。
    借助PA800 plus 的毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)的快速和全自動(dòng)的優(yōu)勢(shì)，可以在線紫外檢測(cè)直接定量蛋白質(zhì)。cIEF方法更、簡(jiǎn)單、快速、可區(qū)分微小差異、分辨率可達(dá)0.01 pH。而且可以提供傳統(tǒng)等點(diǎn)聚焦電泳所無法比擬的重現(xiàn)性。同一個(gè)蛋白藥物在不同PA800 plus儀器及不同時(shí)間進(jìn)行的等電點(diǎn)測(cè)試得到的結(jié)果，一致性非常好，pI測(cè)定的CV<0.1% 。
 
    糖蛋白的糖譜分析

    單克隆抗體藥物和重組蛋白藥物均屬于糖蛋白，糖蛋白中的糖基結(jié)構(gòu)對(duì)于蛋白藥物在體內(nèi)的毒性和半衰期等有著非常重要的影響。從糖蛋白中釋放出來的糖基的分析結(jié)果，可以作為糖蛋白的指紋圖譜。PA800 plus生物制品分析系統(tǒng)和ProteomeLab 糖標(biāo)記分析試劑盒（ProteomeLab carbohydrate labeling and analysis kit) 可用于寡糖和單糖的分析或糖蛋白中糖基的分析和糖譜的制作。其提供快速的糖基釋放和快速分離（一般在15分鐘內(nèi)）。所采用的高靈敏度激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)使得樣品的處理過程非常簡(jiǎn)單方便，僅需要簡(jiǎn)單地稀釋即可快速鑒定分析。
    PA800 plus 所提供的方法的優(yōu)勢(shì)在于：分析特異性好、還原胺化處理和開管模式使得對(duì)糖蛋白水解液的分析無須做任何后處理。配套的硬件、標(biāo)準(zhǔn)化分析和數(shù)據(jù)處理方法、加上的標(biāo)記和檢測(cè)技術(shù)也是的。采用APTS 衍生和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，每個(gè)不同的糖分子可產(chǎn)生等量的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，因此可以直接地對(duì)其含量進(jìn)行比較。CE方法分析糖蛋白的糖鏈，不但可以區(qū)分出一個(gè)糖基的差別，而且對(duì)于相同分子量的糖基異構(gòu)體也可以得到分離。